基因文库

定义

我们通过分子克隆的方法利用微生物群(比如大肠杆菌)来存储并扩增目标DNA片段,该目标DNA集合即称为基因文库。 其中,“文库”可以指生物群(携带有插入了目标DNA的克隆载体的生物),或者指所有克隆的载体分子的集合。

分类

基因文库分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库;如果这个文库包含了某种生物的所有基因,那么,这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,例如cDNA文库,mRNA反转录得到cDNA,从而形成cDNA文库。cDNA文库与基因组文库中的基因的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分,便于DNA重组时直接使用。

部分基因文库

部分基因文库(英语:cDNA library)是以从特定来源(细胞集合,特定组织或整个生物体)纯化的mRNA样品为模板,使用逆转录酶形成的互补DNA与适当的载体连接后转化到受体菌形成的重组菌群。因此,它一定程度上反映了来源细胞在纯化mRNA时的生理环境下活跃转录的基因。

cDNA文库可用于反向遗传学,但它们仅代表给定生物体基因组的非常小(小于1%)的一部分。

cDNA文库的应用包括:

  • 发现新基因
  • 克隆全长cDNA分子用于体外基因功能研究
  • 研究在不同细胞或组织中表达的mRNA
  • 研究不同细胞或组织中的选择性剪接

基因组文库

把某种生物的基因组的全部遗传信息(DNA)切成适当长度的片段,并分别与载体结合,导入微生物细胞,形成克隆。包含基因组中所有DNA序列的克隆的集合,称为基因组文库(英语:Genomic library)。[1]

基因组文库的应用包括:

  • 确定给定生物的完整基因组序列(参见基因组计划
  • 作为通过基因工程产生转基因动物的基因组序列的来源
  • 体外调控序列功能的研究
  • 癌组织中基因突变的研究

构建

克隆载体

克隆载体(英语:Cloning vector)是取自病毒,质粒或高等生物的细胞的一小段DNA,可以在生物体中稳定存在,并可以插入外源DNA片段用于克隆目的。因此,载体有易将DNA片段插入载体或从载体中除去的特征,例如通过用切割DNA的限制酶处理载体和外源DNA。由此产生的DNA片段含有平末端或粘性末端,然后通过分子连接将载体DNA和具有相容末端的外源DNA连接在一起。在将DNA片段克隆到克隆载体中后,可以将其进一步亚克隆到另一种用于更具体用途的载体中。

构建基因文库常常使用的载体有λ噬菌体cosmid载体质粒人工染色体(包括酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC、P1派生人工染色体PAC等)。

载体最常在细菌细胞中繁殖,但如果使用YAC(酵母人工染色体)作为载体,则可以在酵母细胞中繁殖。载体也可以在病毒中繁殖,但这可能是耗时且繁琐的。但通过使用病毒(通常是噬菌体)实现的高转化效率使得它们可用于包装载体,然后将其导入细菌(或酵母)细胞中。

基因组文库的构建

  • 载体DNA片段的制备:使用限制性核酸内切酶对载体DNA分子进行剪切,使之成为线状DNA。
  • 供体DNA片段的制备:对生物体总DNA分离纯化,并使用机械剪切法或酶切法分离出特定大小的DNA片段。
  • 供体与载体DNA的连接:使用DNA连接酶将供体与载体连接成为重组DNA分子。
  • 重组DNA分子的转化:将重组DNA分子转化进入受体细胞。
  • 筛选与保存

cDNA文库的构建

  • 载体DNA片段的制备
  • 多聚RNA的分离与纯化
  • 双链cDNA的合成
    • 第一条cDNA链:逆转录法
    • 第二条cDNA链:碱解或酶解法除去RNA分子
  • cDNA与载体DNA相连
  • 重组cDNA分子的转移

参考:
https://zh.wikipedia.org/wiki/基因文库
https://baike.baidu.com/item/基因文库

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