流式细胞术

流式细胞术是一种生物学技术,用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术(Flow Cytometry,FC)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

其实我也不太会流式细胞术,只是看同学做过一次,做个笔记把主要步骤记录下来,以后再慢慢补充吧!

获取单细胞

从流式细胞术的定义可以看出,我们要做流式必须要确保细胞是一个一个的,也即单细胞,但是我们知道培养细胞时细胞会贴壁生长、接触抑制,等到培养基长满细胞时它们就会连成一片,非常紧密,所以我们首先要将连成一片的细胞相互分离开来,一般用胰蛋白酶或者EDTA解离细胞,这个过程叫消化。

然后还要根据细胞数目的多少将其按一定数量分装到不同的试管,因为流式细胞仪是单通道分析的一次分析的细胞数目有限制。

消化

从细胞培养箱中取出有目标细胞的培养基,倒掉培养基中培养液,用DPBS(2ml)清洗洗两次,加入EDTA(1ml)进行消化(溶解掉细胞间连接的壁),至可用移液枪冲洗出肉眼可见的细胞团(白白的一层),吸掉EDTA,加入WB(wash buffer)(2ml)反复冲洗,将细胞冲落,将所得细胞液转移至离心管中,再次在培养皿上加入WB(2ml)重复上述操作,将所得溶液装入同一离心管中。

计数

拿装有细胞的离心管去离心机离心(800rpm 5min,不要超过1000rpm,不然细胞会破碎),吸掉上清液,留下细胞样品,然后加入2ml WB,用移液枪将其吹匀,吸取5微升细胞液加入到含45微升的小尖端样品管中(相当于稀释了十倍,此步骤用于初步确定细胞密度,细胞太多不好计数,四个小方格,每个小方格计数的平均值乘以1万即细胞计数),拿去用显微镜观察细胞密度(计上不计下,计左不计右)(将样品打入载玻片小孔时,记得先把细胞液吹匀,看完一个样之后,用酒精洗净载玻片,擦干,观察另一个样),如果细胞浓度较高则要WB稀释。

分装

每个细胞准备好6个或3个尖端的样品管,将细胞液吹匀,每个尖管加入20万到30万个细胞,加入体积根据先前的细胞密度算。放于装有冰块的小箱子里(4摄氏度)存放

获取核酸

取5微升核酸样品加入含45微升WB的小样品管中(相当于把核酸稀释10倍)(如果加WB时沾壁,用小离心机离心一下)(有一个是用来做空白对照的不加核酸,但后期要多加入50微升的BB,因为你的核酸样品用WB稀释了,所以要平衡),置于95摄氏度的金属浴中加热10分钟使之变性(核酸样品全程避光,即要关灯,盖上锡箔),然后再置于含冰小箱子上(4摄氏度)10分钟进行复性。拿装有细胞液的管子去离心(1000r/min 3min),吸掉上清液。

混合孵化

核酸与细胞混合后加入150微升BB,而对照组加入200微升BB,然后置于装有冰的箱子里(4摄氏度)摇床摇一小时,该过程称为孵化。

离心处理(1000rpm,5min),吸掉上清液,加入300微升wb(wash buffer),再次离心,吸掉上清液,加入300微升WB。注意离心放置的药品要对称。

流式分析

上样,将试样全部装进流式管中,装样前用枪吹匀试液。将流式管用振荡仪振匀,按到“med”模式,插入流式管,在sample id处标明所测细胞,点击“previous set”重设设置,点击运行,等进度条跑满即可,最后导出数据。

用84洗干净流式管循环使用

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